低致病性禽流感病毒 (LPAIV) H9N2 对动物和人类健康构成重大威胁。罗伊氏乳酸杆菌对宿主免疫系统的有益作用越来越受到关注，这促使人们开始研究它们与宿主免疫系统细胞的相互作用。然而，罗伊氏乳酸杆菌在诱导淋巴组织细胞抗病毒反应方面的作用需要进一步研究。本研究的目的是研究罗伊氏乳酸杆菌对鸡盲肠扁桃体 (CT) 细胞对抗 H9N2 LPAIV 的抗病毒和免疫刺激作用。用罗伊氏乳酸杆菌单独或与 Toll 样受体 (TLR)21 配体 CpG 寡脱氧核苷酸 (CpG) 组合刺激 CT 单核细胞。用罗伊氏乳酸杆菌单独或与 CpG 组合预处理 CT 细胞可显著减少 H9N2 LPAIV 复制。此外，罗伊氏乳酸杆菌单独使用可引发细胞因子表达，包括 IL-2、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12 和 IL-10，而与 CpG 结合时，可观察到（干扰素刺激基因 (viperin)）、IL-12、IL-6、CXCLi2 和 IL-1β 的表达显著增加。然而，这些处理均未引起 CT 细胞一氧化氮生成的显著变化。总之，罗伊氏乳酸杆菌对 CT 细胞具有调节作用，这与增强抗病毒免疫力和减少 H9N2 LPAIV 病毒复制相关。

甲型流感病毒 (IAV) 是一种有包膜病毒，具有节段性、单链、负向 RNA 基因组，属于正粘病毒科。鸡感染禽流感病毒 (AIV) 的特征是传染性病毒颗粒在上呼吸道和胃肠道中存在并复制 。H9 亚型禽流感病毒被归类为低致病性禽流感病毒 (LPAIV)，与高致病性禽流感病毒 (HPAIV) 相比，它们引起的家禽疾病较轻且死亡率较低。H9 亚型病毒在家禽中的出现构成了公共卫生风险，因为它们有可能跨越物种屏障感染人类，最近有关亚洲和非洲人类感染 H9N2 的报道就证明了这一点 。已报道的人类感染病例表明 H9 病毒有可能适应人类，因此可能引发全球大流行。除了对人类和动物健康的担忧外，H9N2 病毒还与肉鸡生长率下降以及种鸡和蛋鸡产蛋量下降有关，这表明这些病毒的重要性。因此，通过疫苗接种或罗伊氏乳酸杆菌在农场控制 AIV 不仅可以减轻家禽生产的经济负担，还可以降低该病毒造成的公共卫生风险。

目前已有针对 H9 AIV 的疫苗，但这些疫苗效果不佳，部分原因是由于病毒存在抗原变异。低致病性禽流感病毒能够在胃肠道中复制。因此，了解这些病毒如何与宿主的肠道相关免疫系统相互作用至关重要。多项研究表明，盲肠扁桃体 (CT) 细胞来源的匀浆中存在传染性 H9 AIV 亚型。此外，已使用定量实时 PCR (qRT-PCR) 在 CT 中检测到了 H9N2 LPAIV 的血凝素 (HA) 和基质 (M) 基因，而使用免疫组织化学证实了 CT 中存在 H7 LPAIV 的病毒核蛋白 (NP)。然而，系统性病毒传播并不局限于 H9N2，因为在 CT 细胞裂解物中也检测到了 H5N1 HPAIV。此外，已证实源自野生鸟类的 H5N6 AIV 可在鸡 CT 细胞中复制，而 H7N3 HPAIV 与鸡 CT 样本中的高组织学和免疫组织化学评分相关。这些 AIV 亚型有可能引起类似于 HPAIV 的全身感染。因此，可以想象，在 CT 中诱导先天反应可以限制病毒复制，从而减少病毒的脱落和传播。

肠道相关淋巴组织 (GALT) 与各种食源性抗原、肠道微生物群和病原体的相互作用在局部和全身免疫反应的产生和调节中起着重要作用。保守的模式识别受体 (PRR) 介导由 CT 引发的先天反应。特征最明显的PRR 是 Toll 样受体 (TLR)，它们是跨膜结合受体和细胞内受体，由哺乳动物和鸟类的各种白细胞表达。TLR 可以选择性识别病原体相关分子模式。 CpG 寡脱氧核苷酸 (ODN) 2007 是一种 TLR21 配体，已显示出作为体外、卵内和体内预防和治疗 AIV 感染的潜力，以及作为佐剂。

除了使用 TLR 配体之外，利用罗伊氏乳酸杆菌治疗已被证明可以在卵内、体内和体外调节宿主反应。事实上，大量研究工作一直致力于揭示特别是罗伊氏乳酸杆菌在生长性能和感染控制方面的有益作用。罗伊氏乳酸杆菌的免疫调节活性部分在于它们能够诱导细胞因子的产生，进而调节先天性和适应性免疫反应。最近的证据表明，用作罗伊氏乳酸杆菌的细菌种类和菌株对宿主反应有不同的影响。研究表明，在鸡中使用罗伊氏乳酸杆菌乳酸菌不仅能诱导肠粘膜免疫，还能诱导全身免疫反应，其特征是总血清抗体滴度增加，与脾脏 B 细胞和 T 细胞相关的各种免疫系统基因表达发生显著改变，从而保护鸡免受 AIV 的侵害。尽管我们目前对 CT 细胞反应有所了解，但对 CT 细胞对 AIV 感染诱导的免疫反应需要更深入的了解。

先前的研究表明，CT 细胞在接触罗伊氏乳酸杆菌和 TLR 配体（如 CpG ODN）后能够产生强大的免疫反应。然而，对于这些反应在保护机体免受病毒感染（特别是 AIV）方面的作用，人们还缺乏了解。因此，本研究的目的是确定 H9N2 AIV 在鸡盲肠扁桃体细胞中的感染性，并检查益生菌乳酸杆菌在体外诱导有效的抗病毒和炎症反应以及限制病毒在这些细胞中复制的潜力。

实验动物

从加拿大食品检验局（加拿大安大略省渥太华）购买了 24 只 1 日龄无特定病原体 (SPF) 白来航蛋鸡。这些鸡被分组、圈养，并在加拿大圭尔夫大学安大略兽医学院的隔离设施中自由进食和饮水。所有实验程序均经圭尔夫大学动物护理委员会批准，并根据加拿大动物护理委员会动物利用协议编号 4203 的规定进行，所有实验均在 2019-2020 年进行。

扁桃体单个核细胞的制备

从三周大的蛋鸡中无菌收集整个 CT，并储存在冰上磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中，该缓冲液添加了青霉素 (10 U/mL) 和链霉素 (10 µg/mL)。切开 CT 组织样本，用添加的 PBS 清洗三次，然后切成薄片。随后用添加的 PBS 中的胶原酶 1 (Sigma-Aldrich，加拿大安大略省奥克维尔) 消化组织样本；80 U/mL，37 °C，20 分钟)。将整个组织消化液涂在 40 μm 细胞过滤器 (BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞) 上，并使用 10 mL 注射器柱塞的平端压碎。 CT 细胞悬浮液按 2:1 的比例分层到 Histopaque 1077（Sigma-Aldrich，加拿大安大略省奥克维尔）密度梯度上，以 400× g 的速度离心 20 分钟，以分离单核细胞。随后从界面吸出单核细胞，在含有青霉素（10 U/mL）和链霉素（10 μg/mL）的RPMI 1640（Gibco ®，Life Technologies，美国新泽西州伯灵顿）中以 400×g 的速度清洗 5 分钟。将单核细胞悬浮在完全 RPMI 细胞培养基中；RPMI 1640 培养基含有 0.2% 牛血清白蛋白、25 mM HEPES（Gibco ®，Life Technologies，美国新泽西州伯灵顿）、青霉素（10 U/mL）和链霉素（10 μg/mL）。使用血细胞计数器和台盼蓝排斥法评估细胞数量和活力。将单核细胞悬浮在完全 RPMI 细胞培养基中，密度为 1 × 10 7 个细胞/毫升。为后续每项实验准备了来自八只鸡的 CT 单核细胞，包括感染 AIV、评估抗病毒活性以及量化基因表达和一氧化氮生成。

益生菌乳酸杆菌种类、培养基和生长条件

在本研究中，使用了三种禽类乳杆菌混合物，包括唾液乳杆菌、约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。细菌分别在 De Man、Rogosa 和 Sharpe (MRS) 肉汤（Becton Dickinson，加拿大安大略省密西沙加市）中厌氧培养，37 °C 下不振荡培养 24 小时，并传代培养两次。在稳定生长期开始时（接种后六小时）通过离心（3000× g， 10 分钟）收获细菌。然后用 PBS 洗涤沉淀的细菌三次并悬浮在 PBS 中。在 100 °C 的水浴中加热灭活乳酸杆菌 30 分钟。通过 MRS 琼脂平板上没有菌落形成来证实灭活。

TLR 配体

合成的 B 类 CpG ODN 2007 用作 TLR21 配体 [5′-TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT-3′]（InvivoGen，美国加利福尼亚州圣地亚哥 Vista Sorrento Pkwy），具有硫代磷酸酯骨架 (CpG)。在无内毒素水中重构 CpG，并使用 RPMI 1640 培养基稀释至 5 µg/mL 的工作浓度。该浓度之前已被证明是最佳浓度 [ 21 ]。

 病毒株

本研究使用了一种 LPAIV，A/TK/IT/13VIR1864-45/2013 (H9N2)。病毒在 37 °C 下在 10 日龄鸡胚中繁殖 72 小时。每 24 小时监测一次胚胎，丢弃死胚胎。孵化后，将鸡蛋在 4 °C 下冷藏过夜。然后收集尿囊液，以 400× g离心 5 分钟，然后储存在 −80 °C 下直至下次使用。使用 Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞，根据 50% 组织培养感染剂量 (TCID 50 ) 确定病毒滴度。

H9N2 AIV 感染 CT 细胞

CT 单核细胞（n = 8 个生物学重复）（100 µL RPMI 培养基中10 6 个细胞/孔）在 41 °C 和 5% CO 2 的条件下以 1 的感染复数 (MOI) 感染 H9N2 AIV 一小时。在初步实验中，测试了不同的 MOI（0.01、0.1 和 1）以确定 H9N2 AIV 在 CT 单核细胞中复制的最佳 MOI。然后离心培养皿，并弃去上清液。用培养基清洗单核细胞并再次离心以去除病毒残留物。随后，将单核细胞悬浮在含有 2 µg/mL L-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮 (TPCK) 处理的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich；目录号 T1426）的新鲜完全 RPMI 1640 培养基中。每个时间点和每个生物学重复留出一个孔未感染。感染后 (hpi)，将单核细胞在 41 °C 加湿 5% CO 2环境中孵育 0、6、12、18、24 和 30 小时。收集每个时间点的细胞培养上清液并储存在 −80 °C 下进行病毒滴定。

罗伊氏乳酸杆菌混合物和/或CpG ODN 2007刺激CT细胞

对于每个样本（n = 8 个生物学重复），将 100 µL 单核细胞悬浮液（10 6细胞/孔）接种到 96 孔圆底板中。用 5 µg/mL CpG、10 7 个益生菌乳酸杆菌混合物 (PROB) 菌落形成单位 (CFU) 或单独 10 8 CFU PROB 或 5 µg/mL CpG 与 10 7或 10 8 CFU PROB的组合刺激CT 单核细胞。在每个时间点使用 PBS 处理作为阴性对照。随后将 CT 单核细胞在 41 °C 的加湿 5% CO 2环境中孵育。在刺激后 (hps) 3、6 和 24 小时收获单核细胞并在 TRIzol ®中裂解以分离 RNA（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。由于从单个鸟类的扁桃体中分离出的细胞数量很少，RNA 产量低，因此将 RNA 样本汇集在一起 ，每个时间点每个治疗组总共有四个生物学重复，随后用于 qRT-PCR 分析（表 1）。根据制造商的方案（美国威斯康星州麦迪逊市 Promega 公司），在 3、6 和 24 hps 收集刺激的 CT 单核细胞的上清液，使用 Griess 测定法对 NO 进行量化。

表 1.

用于实时定量 PCR 的引物序列。

基因

引物序列 (5′-3′) 

(F = 正向；R = 反向)

退火

温度（℃）

GenBank 登录号

干扰素-γ

F：TGGCGGCGGGGAGGAAAAGTG

60

NM_001030558

R：CACCGTGCTCCAGCTCAGGC

白介素-1β

F：GTGAGGCTAACATTGCCTGTA

64

Y15006

R：TGTCCAGGCGTAGAAGATGAAG

IL-10

F：AGCAGATCAAGGAGACGTTC

55

AJ621614

R：ATCAGCAGGTACTCCTCGAT

IL-12p40

F：CCAAGACCTGGAGCACACCGAAG

60

AY262752.1

R：CGATCCCTGGCCTGCACAGAGA

白细胞介素-2

F：GCAGGGCAGGTTCAGGTGGG

58

NM_204153.1

R：GCCACACAGCCTGGCTCCCT

白细胞介素-6

F：CTGAAGAACTGGACAGAGAG

60

NM_204628.1

R: CACCAGCTTCTGTAAGATGC

CXCLi2

F：CTGAAGGTGCAGAAGCAGAG

64

AJ009800

R：CCAGCTCTGCCTTGTAGGTT

MDA5

F：GCAAAACCAGCACTGAATGGG

60

GU570144.1

R: CGTAAATGCTGTTCCACTAACGG

转化生长因子-β

F：CGGGCCGACGATGAGTGGCTC

60

M31160.1

R：CGGGGCCCATCTCACAGGGA

毒蛇素

F：GGAGGGCGGGAATGGAGAAAA

60

KY856894.1

R: CAGCTGGCCTACAAATTCGC

β-肌动蛋白

F：CAACACAGTGCTGTCTGGTGGTA

60

X00182

R：ATCGTACTCCTGCTTGCTGATCC

评估罗伊氏乳酸杆菌/或CpG ODN 2007刺激的CT单核细胞的抗病毒活性

如上所述刺激来自八只鸡的 CT 单核细胞（100 µL RPMI 培养基中 10 6 个细胞/孔）。刺激 24 小时后，弃去上清液，在 41 °C 和 5% CO 2 条件下，用 H9N2 AIV 以 MOI 1 感染单核细胞 1 小时。然后清洗单核细胞，并将其悬浮在含有 2 µg/mL TPCK 处理的胰蛋白酶的完全 RPMI 1640 培养基中。随后在 41 °C 的加湿 5% CO 2环境中孵育单核细胞，并在感染后 6 h 收集上清液，并储存在 −80 °C 下，以便随后进行病毒滴定。

2.9. RNA 提取和互补单链 DNA (cDNA) 合成

定量实时 PCR

使用 SYBR Green (Roche) 对稀释 (1:10) cDNA 进行 qRT-PCR，使用 LightCycler 480 II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)，方法与先前所述并进行了一些修改 [ 18 ]。简而言之，扩增条件包括 94 °C 预孵育 10 分钟，然后进行 45 个循环，每个循环 95 °C 10 秒，55–64 °C 退火（如表 1所述，每个引物退火 5 秒，72 °C 延伸和信号采集（单一模式）10 秒。随后通过加热至 95 °C 10 秒，冷却至 65 °C 1 分钟，然后加热至 97 °C 进行熔化曲线分析。引物由 Sigma Aldrich 合成。引物的具体序列列于表 1中。

统计分析

使用 LightCycler ® 480 II（Roche Diagnostics GmbH）上的软件，计算相对于管家基因 β-actin 的基因表达。数据代表四个生物学重复的平均值±平均值的标准误差。使用 SAS ®（SAS Institute，Inc. ，北卡罗来纳州卡里，美国）通过单因素方差分析对 CT 细胞中病毒复制（时间点之间）和基因表达（一个时间点内不同处理之间）的多种处理进行数据分析。使用Duncan多重极差检验的多重比较结果在p< 0.05 时被认为是显著的。当数据不呈正态分布时（不同处理之间的抗病毒反应量化），使用 Kruskal-Wallis 检验。当p < 0.05 时，认为平均值有显著差异。

结果

低致病性 H9N2 AIV 在鸡 CT 单核细胞中的复制

使用 TCID 50测定法对细胞培养上清液中的感染性病毒进行量化，以分析病毒感染和复制情况。在未感染的阴性对照细胞中未观察到病毒复制，而 H9N2 LPAIV 感染的细胞在感染后的各个时间点均存在病毒复制水平。在用不同 MOI（0.01、0.1 和 1）感染的细胞上清液中观察到 H9N2 LPAIV 滴度的剂量依赖性增加，并且 MOI 为 1 时在 CT 单核细胞中的感染率最高。因此，我们选择在 CT 单核细胞中的所有后续感染中使用 MOI 为 1 的情况。结果还显示，与感染 0 hpi 时（5.47 × 10 6 TCID 50 /mL）相比，6 hpi 时的病毒滴度（1.09 × 10 7 TCID 50 /mL）有中等但显著的增加。与 6 hpi 相比，病毒滴度在 12、18、24 和 30 hpi 显著下降（图 1）。

图 1.

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低致病性 H9N2 AIV 在鸡扁桃体 (CT) 单核细胞中的复制动力学。用低致病性禽流感病毒 H9N2 感染无特定病原体鸡的 CT 单核细胞（n = 8 个生物学重复），感染 MOI 为 1。一小时后，用补充有 2 µg/mL TPCK-胰蛋白酶的完全 RPMI 1640 培养基清洗 CT 单核细胞并培养，然后在 41 °C 和 5% CO 2下孵育 30 小时。PBS 用作阴性对照。在感染后 0、6、12、18、24 和 30 小时收集细胞上清液，并使用 MDCK 细胞测定病毒滴度。病毒滴度表示为 50% 组织培养感染剂量 (TCID 50 /mL)。误差线表示平均值的标准误差，不同的字母表示时间点之间的显著差异（p < 0.05）。

罗伊氏乳酸杆菌单独或与CpG ODN联合刺激鸡CT单核细胞可限制H9N2 LPAIV复制

为了评估罗伊氏乳酸杆菌在 CT 细胞中的抗病毒活性，用不同的处理方法体外刺激细胞，包括CpG、两种浓度的罗伊氏乳酸杆菌、CpG 与两种不同浓度的罗伊氏乳酸杆菌的组合或 PBS。刺激 24 小时后，洗涤细胞并以 MOI 为 1 用 H9N2 AIV 感染 6 小时。如图2所示，与 PBS 处理的阴性对照组相比，用 CpG、10 7CFU 罗伊氏乳酸杆菌或 CpG 与 10 7 CFU 罗伊氏乳酸杆菌处理的单核细胞病毒滴度降低最为显著（p< 0.05）。10 8 PROB 组和 CpG+10 8PROB 组之间的病毒滴度没有差异。CpG+10 8 PROB 组的病毒滴度与 PBS 组没有显著差异。

图 2.

用罗伊氏乳酸杆菌混合物和/或 CpG ODN 2007 刺激后评估 CT 单核细胞的抗病毒活性。用益生菌乳酸杆菌混合物（ L. salivairus、L. johnsonii 和 L. reuteri ）和/或 CpG ODN 2007刺激鸡的 CT 单核细胞（ n = 8 个生物学重复）。刺激 24 小时后，去除细胞培养上清液，然后用 H9N2 AIV 感染细胞，感染 MOI 为 1，持续 1 小时。然后清洗 CT 单核细胞并将其悬浮在完全 RPMI-1640 培养基中，并添加 2 µg/mL TPCK-胰蛋白酶。将细胞在 41 °C 和 5% CO 2下孵育6 hpi。收集细胞培养上清液，在 MDCK 细胞上进行病毒滴定。使用 50% 组织培养感染剂量测定法滴定病毒，并以 log 10 TCID 50 /mL 表示。显示了平均值的标准误差。带有不同字母的条形图彼此之间有显著差异（p < 0.05）。治疗组为：5 µg/mL CpG ODN 2007 (CpG)、10 7 CFU 罗伊氏乳酸杆菌 (10 7 PROB)、10 8 CFU 罗伊氏乳酸杆菌 (10 8 PROB)、CpG+10 7 PROB、CpG+10 8PROB 和磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。

罗伊氏乳酸杆菌单独或与CpG ODN联合刺激鸡CT单核细胞不诱导CT细胞产生NO

为了研究罗伊氏乳酸杆菌影响 CT 细胞的机制，我们用不同浓度的罗伊氏乳酸杆菌单独或与 CpG ODN 联合刺激 CT 细胞。然后我们测量了 CT 细胞上清液中的 NO。NO 是由诱导型 NO 合酶表达的初始刺激形成的。NO 是一种众所周知的内源性分子，可对免疫系统产生刺激和抑制作用 [ 42 , 43]。我们的结果表明，与 PBS 处理的细胞相比，在所有时间点，用罗伊氏乳酸杆菌单独或与 CpG ODN 联合刺激 CT 单核细胞不会影响 NO 的产生（图 3）。

图 3.

罗伊氏乳酸杆菌和/或 CpG 刺激后 CT 单核细胞产生一氧化氮 (NO)。用罗伊氏乳酸杆菌混合物和/或 CpG ODN 2007 刺激鸡的 CT 单核细胞（ n= 8 个生物学重复）3、6 和 24 小时。使用 PBS 或 RPMI 1640 作为载体对照。在每个时间点，收集上清液并用于 Griess 测定以量化 CT 单核细胞产生的 NO。误差线表示平均值的标准误差。治疗组为：5 µg/mL CpG ODN 2007 (CpG)、10 7 CFU 罗伊氏乳酸杆菌 (10 7PROB)、10 8 CFU 罗伊氏乳酸杆菌 (10 8 PROB)、CpG+10 7 PROB、CpG+10 8 PROB 和磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。

罗伊氏乳酸杆菌刺激鸡CT单核细胞诱导细胞因子、趋化因子和抗病毒基因表达

在 3 hps 时，与 PBS 处理的细胞相比，用 CpG+10 7 PROB 或 CpG+10 8 PROB处理单核细胞可诱导白细胞介素 (IL)-6 和 CXCLi2 表达显著更高 (图 4 A、B)。与 PBS 处理的细胞相比，用 CpG、10 8 PROB 或 CpG 与任一浓度的罗伊氏乳酸杆菌组合处理的组中 IL-12p40 和 IFN-γ 基因表达更高(图 4E、F)。与所有其他组相比，用 CpG 与任一浓度的乳酸杆菌组合处理可诱导显著更高的 IL-10 表达 (图 4G)，而用 CpG 与 10 7PROB 组合处理可诱导最高的 viperin 基因表达 (图 4 J)。我们没有观察到 3 hps 时所有处理之间 IL-1β、IL-2、转化生长因子-β (TGF-β) 或黑色素瘤分化相关蛋白 5 (MDA5) 基因表达的显著差异（分别为图 4C、D、H、I）。

图 4.

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罗伊氏乳酸杆菌和/或 CpG 刺激后鸡 CT 单核细胞中细胞因子、趋化因子和抗病毒基因的相对表达。用罗伊氏乳酸杆菌混合物和/或 CpG ODN 2007 刺激鸡的 CT 单核细胞（ n = 8/治疗组） 3、6 和 24 小时。使用 PBS 或 RPMI 1640 作为载体对照。在每个时间点，将 CT 单核细胞收集在 TRIzol ®中以提取 RNA。由于 RNA 产量低，RNA 样本在 RNA 提取后汇集。每个治疗组每个时间点有四个生物学重复。在 cDNA 合成和 qRT-PCR 后，确定了靶基因以及管家基因（β-肌动蛋白）的表达水平。表达水平显示为相对于 β-肌动蛋白。误差线表示四次生物学重复的平均值的标准误差。不同的字母表示某一时间点内不同处理之间的显著差异（p < 0.05）。处理组为：5 µg/mL CpG ODN 2007 (CpG)、10 7 CFU 乳酸杆菌 (10 7 PROB)、10 8 CFU 乳酸杆菌 (10 8PROB)、CpG+10 7 PROB、CpG+10 8 PROB 和磷酸盐缓冲液 (PBS)。

在 6 hps 时，用 CpG 或 CpG 与任一浓度的罗伊氏乳酸杆菌组合处理的细胞与其他处理相比，IL-6、CXCLi2、IL-1β 和 IL-12p40 基因表达显著 (分别为图 4 A–C、E)。与 PBS 处理相比，用 CpG 与任一浓度的罗伊氏乳酸杆菌组合处理可诱导更高的 IL-2 和 viperin 基因表达 (图 4 D、J)。在此时间点，所有处理之间在 IFN-γ、IL-10、TGF-β 和 MDA5 方面均无显著差异 (分别为图 4 F、G、H、I)。

在 24 hps 时，用 10 7 PROB处理单核细胞会下调 CXCLi2 和 IL-2 的基因表达；相反，与CpG 和 PBS 处理相比，用 CpG+10 8 PROB 处理可增加 IL-2 的表达（分别为图 4B、D）。与所有其他处理相比，用 CpG+10 7 PROB 处理可显著诱导更高的 IL-12p40 基因表达，而用 CpG+10 8 PROB 处理可显著诱导更高的 IL-10 表达（图 4E 、G）。与用 CpG 和 PBS 处理的细胞相比，用 CpG+10 8 PROB 处理的细胞中 IL-1β 基因表达更高（图 4C ）。与 10 7 PROB 处理相比，用 CpG 与任一浓度的罗伊氏乳酸杆菌联合处理均可诱导更高的 viperin 表达（图 4J）。此时所有处理之间 IL-6、IFN-γ、TGF-β 和 MDA5 基因表达均无显著差异（分别为图 4 A、F、H、I）。

讨论

越来越多的证据表明，GALT、肠道微生物群和对病毒的反应之间存在关联。最近的一系列实验表明，鸡感染 H9N2 AIV 会破坏肠道微生物群的组成，使宿主易受病毒复制增加的影响，从而导致病毒脱落增加 [ 2 , 35, 44 ]。盲肠扁桃体是禽类 GALT 的主要淋巴组织。CT 早在胚胎孵化日 (EID) 10 天时就出现在鸡胚中，到胚胎孵化日 18 天时即可检测到淋巴细胞。盲肠扁桃体具有独特的多细胞组成，包括特殊的淋巴上皮、异质性的 B 细胞和 T 细胞群以及单核吞噬细胞，这使其成为诱导针对鸡肠道 H9N2 AIV 感染的先天性和适应性免疫反应的潜在靶点。

在鸡中，肠膜明串珠菌YML003 在体外和体内均表现出对 H9N2 LPAIV 的抗病毒活性。同样，罗伊氏乳酸杆菌对 H9N2 病毒具有免疫调节作用 。此外，我们小组的一项研究表明，抗生素消耗肠道菌群和粪便移植重建微生物群对 H9N2 病毒免疫力的影响。总之，这些研究强调了肠道共生微生物、宿主免疫系统以及最终对抗入侵病原体的免疫力之间的关系的重要性。

在本研究中，我们发现 CT 为 H9N2 LPAIV 提供了复制环境，这种病毒在体外 CT 单核细胞中的复制证明了这一点。这些发现促使我们研究用罗伊氏乳酸杆菌预先处理是否能引发 CT 中的先天性和抗病毒反应，从而有效抑制 AIV 在这些细胞中的复制。因此，在本研究中，我们使用罗伊氏乳酸杆菌，因为它们对各种淋巴器官和免疫系统细胞（包括 CT 单核细胞）具有免疫调节作用 [ 18,34 ]。CpG 已显示出对体外免疫相关基因表达的显著影响 [ 21 ]；因此，我们还试图研究乳酸杆菌和 CpG 的组合是否具有附加或协同的抗病毒和免疫刺激作用。本研究结果显示，无论浓度如何，单独使用罗伊氏乳酸杆菌或与 CpG ODN 组合治疗 CT 细胞均可降低 AIV 复制。这一结果可归因于罗伊氏乳酸杆菌的免疫刺激能力，该能力可诱导 CT 细胞对 AIV 产生有效的免疫反应。

因此，我们进一步研究了罗伊氏乳酸杆菌刺激后在 CT 细胞中诱导抗病毒反应的机制。鉴于 NO 在宿主防御入侵病原体（包括病毒、细菌和原生动物）中的重要作用 [ 42、43、48、49 ]，我们评估了罗伊氏乳酸杆菌对 CT 单核细胞产生 NO 的影响。事实上，NO 对 AIV 感染的抗病毒活性仍然存在争议。一些研究表明 NO 具有抑制流感病毒复制的潜力，而另一些研究表明 NO 导致流感病毒感染的致病结果  。在本研究中，CpG ODN、罗伊氏乳酸杆菌或它们的组合均不能诱导 CT 单核细胞产生 NO。尽管如此，这些结果必须谨慎解读，因为这些细胞无法产生 NO 可能是由于 CT 单细胞悬浮液中的巨噬细胞数量较少，或混合物中罗伊氏乳酸杆菌的抵消作用。最近的一项研究结果支持了这一假设；罗伊氏乳酸杆菌则显著降低了 NO 的产生 。

我们还评估了与 T 辅助细胞 1 型 (Th1) 应答 (IL-2 和 IFN-γ) 相关基因的表达，因为它们在宿主防御细胞内微生物因子和病毒中起着关键作用。活化的 Th1 细胞是 IL-2 的主要来源，IL-2 是一种炎性细胞因子，可驱动幼稚 T 细胞分化为效应 T 细胞 [ 54]。IFN-γ 是强效的巨噬细胞激活剂，具有强效的抗病毒特性 [ 55 , 56 ]。研究表明，IFN-γ 通过诱导吲哚胺 2,3-双加氧酶和一氧化氮合酶等不同机制抑制病毒复制 [ 57 , 58 ]。本研究结果表明，无论浓度和时间点如何，CpG 和乳酸杆菌的组合均增强了 IL-2 和 IFN-γ 的表达。与我们的结果一致，Yitbarek 等人研究表明，给肠道菌群耗尽的鸡施用同一种罗伊氏乳酸杆菌可以恢复脾脏中 IFN-γ 的转录水平 。

鉴于促炎细胞因子和趋化因子在启动炎症反应以帮助控制病毒增殖方面发挥着重要作用 [ 18 ]，我们测量了在单独暴露于罗伊氏乳酸杆菌或与 CpG ODN 结合后 CT 细胞中 IL-12p40、IL-6、CXCLi2 和 IL-1β 的表达。结果表明，与阴性对照相比，单独使用罗伊氏乳酸杆菌处理能够诱导更高的 IL-1β 和 IL-12 表达，而与 CpG ODN 结合时，IL-12、IL-6、CXCLi2 和 IL-1β 表达显著增强。然而，目前尚不清楚这是由于附加效应还是 CpG ODN 介导的显性效应，因为在单独用 CpG ODN 处理的细胞中观察到了这些细胞因子的显著表达。尽管如此，罗伊氏乳酸杆菌单独表现出诱导 IL-12、IL-6 和 IL-1β 表达的能力。因此，口服罗伊氏乳酸杆菌可以调节 GALT 中的免疫反应，最终导致病毒复制减少并保护宿主免受感染 。

IL-10 是一种免疫调节细胞因子，它通过在炎症过程结束时关闭促炎细胞因子的合成，在维持免疫稳态中起着至关重要的作用 。它在 B 细胞存活和分化中也起着至关重要的作用 。本研究结果表明，益生菌乳酸杆菌单独使用或与 CpG 联合使用可诱导 CT 细胞中 IL-10 表达增加，这表明了它们的免疫调节特性 。

作为细胞抗病毒机制的一部分，对 MDA5 和 viperin 的表达进行了研究。由于鸡缺乏 RIG-I，因此鸡 MDA5 （而不是 TLR）在识别 RNA 配体（包括流感病毒基因组）中起着至关重要的作用。同时，鸡 MDA5 不参与细菌 RNA 识别。此处，MDA5 表达不受任何处理的影响。这种没有影响可能是因为本研究中使用的完整、灭活乳酸杆菌无法识别 RNA。此外，据报道，MAD5-MAVS 信号的异常激活会导致自身免疫性疾病。因此，乳酸杆菌处理后 MDA5 表达没有变化可能进一步支持其在维持免疫稳态中免疫调节作用的观察结果。

Viperin 是一种干扰素刺激基因，可减少病毒复制和脱落，并防止流感病毒颗粒从受感染细胞中释放 。用 CpG 和罗伊氏乳酸杆菌组合处理 CT 细胞可导致 Viperin 表达增加。相比之下。罗伊氏乳酸杆菌在诱导 Viperin 表达方面所观察到的作用表明罗伊氏乳酸杆菌具有潜在的抗病毒特性。

总体而言，罗伊氏乳酸杆菌明显表现出抗病毒和免疫刺激能力，如本研究所示，它们能够引发抗病毒反应（干扰素刺激基因 (viperin)）并在 CT 细胞中产生强大的细胞因子表达，包括 Th1 型细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ）、促炎细胞因子（IL-1β 和 IL-6）以及免疫调节细胞因子（IL-10）。重要的是，罗伊氏乳酸杆菌处理的细胞中同时诱导促炎和抗炎细胞因子表明罗伊氏乳酸杆菌在维持免疫系统稳态方面发挥着作用。

结论

总之，本研究表明，罗伊氏乳酸杆菌单独或与 CpG ODN 结合具有诱导和调节鸡免疫系统细胞中特定免疫相关基因的潜力，这通过显著诱导 IL-2、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12 和 IL-10 转录本得到证明。此外，用罗伊氏乳酸杆菌预处理盲肠扁桃体细胞可显著减少 H9N2 AIV 复制。考虑到罗伊氏乳酸杆菌的免疫调节能力以及盲肠扁桃体产生抗病毒反应的能力，本研究结果表明使用罗伊氏乳酸杆菌可促进鸡对 H9N2 AIV 的胃肠道免疫。有必要进一步研究这些细菌在 CT 细胞中诱导抗病毒免疫的不同机制。