维生素D对维持骨骼健康至关重要。我们需要它来吸收钙。我们所需的维生素D大部分来自阳光，但也有一些来自饮食。

英国政府建议所有英国民众在秋冬季节考虑服用10微克维生素D。一些有维生素D缺乏风险的成年人则建议全年服用补充剂。

在骨关节炎 (OA) 的病理过程早期，软骨下骨重塑与成骨细胞代谢改变相关。本研究探讨了在人类 OA 软骨下骨中，硫酸软骨素 (CS)、硫酸葡萄糖胺 (GS) 或两者共同作用是否会影响主要的骨生物标志物——骨保护素 (OPG)、核因子 κB 受体激活剂配体 (RANKL)——以及 OA 成骨细胞的促骨吸收活性。在有或没有 1,25(OH) 2D3（维生素 D3 ） （50 nM ）的情况下，CS（200 μg/mL）、GS（50 和 200 μg/mL）或两者共同对人类 OA 软骨下骨成骨细胞的影响，测定了对骨生物标志物碱性磷酸酶和骨钙素的影响，对骨重塑因子 OPG 和 RANKL 的表达（mRNA）和产生（酶联免疫吸附试验）的影响，以及对这些细胞的促吸收活性的影响。对于后者实验，将人类 OA 成骨细胞与分化的外周血单核细胞在亚微米合成磷酸钙薄膜上孵育。数据显示，CS 和 GS 既不影响基础碱性磷酸酶也不影响维生素 D3诱导的碱性磷酸酶或骨钙素的释放。有趣的是，在基础条件下或维生素 D 3处理下，CS 以及 CS 和 GS 共同孵育均可上调OPG 的表达和产生。在基础条件下， CS 和两种药物共同孵育均可显著降低RANKL 的表达。在维生素 D 3作用下，这些药物也显示RANKL水平下降，但未达到统计学意义。

重要的是，在基础条件下，CS 和两种化合物联合使用可显著上调OPG/RANKL的表达比率。维生素 D 3降低了该比率，而 GS 进一步降低了该比率。两种药物均降低了骨吸收活性，并且 GS 以及 CS 和 GS 共同孵育时均达到了统计学意义。我们的数据表明，CS 和 GS 不会过度影响细胞完整性或骨生物标志物。然而，CS 和两种化合物联合使用会增加OPG/RANKL的表达比率，表明对 OA 软骨下骨结构变化有积极影响。CS 和 GS 联合使用时骨吸收活性的降低证实了这一点。这些数据具有重要意义，可能有助于解释这两种药物如何对 OA 病理生理产生积极影响。

骨关节炎(OA)是最常见的关节疾病之一，约65%的60岁以上老年人患有此病，其中许多人饱受疼痛和功能障碍的折磨，并造成沉重的社会和经济负担。尽管OA患病率很高，但其确切病因尚不完全清楚，尽管近几十年来对其研究取得了显著进展。

OA 被认为是一种复杂的疾病，其中关节组织（包括软骨、滑膜和软骨下骨）发挥着重要作用 。尽管关节软骨破坏是 OA 的主要特征，但我们仍未完全了解软骨退化和丢失的诱因。滑膜炎症被认为在关节组织病变的进展中起着重要作用；然而，普遍的共识是，OA 中的滑膜炎症并非该疾病的主要原因，而是与多种因素相关的次要现象，包括软骨基质退化。此外，研究还表明，在 OA 中，软骨下骨并非无辜的旁观者，而是多种动态形态变化的发生部位，这些变化似乎是疾病过程的一部分 。这些变化与成骨细胞代谢改变相关的多种局部异常生化途径有关。

一些化合物已被证明对 OA 有缓慢起效的症状作用，被称为 SYSADOA。这类药理物质包括硫酸软骨素 (CS) 和硫酸葡萄糖胺 (GS)。人们已经研究了使用这两种药物对 OA 进行症状和结构管理的几种策略。有令人信服的证据表明，对于膝关节和手关节 OA 患者，CS 和 GS 有可能抑制 OA 的结构性进展。此外，最近的葡萄糖胺/软骨素关节炎干预试验经过探索性分析表明，这两种药物的组合对患有中度至重度膝关节疼痛的OA 患者的症状有效。

葡萄糖胺是一种氨基糖，是糖胺聚糖 (GAG 链) 生物合成的优选底物，随后也是聚集蛋白聚糖和其他蛋白聚糖生成的优选底物。CS 是许多结缔组织细胞外基质的主要成分，包括软骨、骨、皮肤、韧带和肌腱。它是一种硫酸化的 GAG，由长的无支链多糖链组成，具有N-乙酰半乳糖胺和葡萄糖醛酸的重复二糖结构。大多数N-乙酰半乳糖胺残基都被硫酸化，特别是在 4 位或 6 位，使其成为带强电荷的聚阴离子。许多富含亮氨酸的小蛋白聚糖，尤其是核心蛋白聚糖和双糖链聚糖（含有高水平的 CS 链），存在于骨细胞外基质区室中 。据报道，在 OA 关节组织中，CS 的结构发生了变化，出现了更长的链 。在体外研究中，GS和CS已被证明能够减少促炎因子，改变细胞死亡过程，并改善细胞外软骨基质的合成/分解平衡。此外，CS已被证明对OA滑膜有积极作用。然而，其确切的作用机制仍不清楚，其对软骨下骨重塑相关因素的作用也从未被研究过。

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虽然软骨下骨硬化出现在骨关节炎晚期，但多项体内和体外研究表明，涉及骨吸收的软骨下骨重塑发生于疾病早期。已证实人类 OA 软骨下骨的成骨细胞能产生过量的多种生化因子，这些因子有利于破骨细胞的成熟/活化和/或骨基质的吸收。在人类 OA 软骨下骨成骨细胞中发现，在骨吸收中发挥重要作用的两种主要因子——骨保护素 (OPG) 和核因子 κB 受体激活剂配体 (RANKL)——水平异常 [ 11 ]。这两种因子均由成骨细胞合成，而 RANKL 是肿瘤坏死因子超家族的成员，是破骨细胞分化和骨质流失的关键细胞因子。另一方面，OPG被认为是一种诱饵受体，它能阻断RANKL与破骨细胞前体上的RANK受体结合，从而抑制破骨细胞分化的终末阶段，抑制其活化，并诱导成熟破骨细胞凋亡。因此，OPG通过阻止破骨细胞生成来抑制骨吸收。

成骨细胞生物标志物

先前对人类 OA 软骨下成骨细胞的研究表明，这些细胞具有异常的骨生物标志物水平 [ 12、13、16、17 ] （在本研究中，我们首先研究了两种这样的生物标志物，即碱性磷酸酶和骨钙素。数据显示，碱性磷酸酶活性和骨钙素对维生素 D3 有反应，正如对人类软骨下骨成骨细胞的预期一样，碱性磷酸酶和骨钙素分别比基础值增加约 1.5 倍和 8 倍。碱性磷酸酶和骨钙素都不会真正受到 CS 或 GS 单独或共同的影响；对于基础条件和激素刺激都是如此。所有处理过的样本都趋向于显示出更高水平的维生素 D3诱导的骨钙素释放。

人类骨关节炎软骨下骨成骨细胞中的碱性磷酸酶和骨钙素水平。在存在或不存在50 nM维生素D 3的情况下，用硫酸软骨素 (CS) (200 μg/mL)、硫酸葡萄糖胺 (GS) (50 或 200 μg/mL) 或两者 (各 200 μg/mL) 处理后测定碱性磷酸酶活性 ( a)和骨钙素水平 (b) 。碱性磷酸酶活性(a)通过使用对硝基苯磷酸酯的底物水解来测定细胞裂解物中的碱性磷酸酶活性，而骨钙素水平(b)通过使用特异性酶免疫测定法在培养基中测定。数据来自八个独立实验。通过配对学生t检验评估统计学显着性。P值表示对照组（C，基础条件）和维生素 D 3处理样本之间的统计学差异。

骨保护素和RANKL的表达和合成

维生素D 3处理未改变OPG的表达 。在基础条件下，当CS和GS一起孵育时，OPG的表达显著增加。CS在基础条件（轻微）或维生素D 3诱导下均显示出OPG表达水平的升高（p < 0.06）。有趣的是，在维生素D 3存在的情况下，CS将OPG的表达上调至与两种药物处理时相似的水平。

人类骨关节炎软骨下骨成骨细胞中的骨保护素 ( OPG )、核因子 κB 受体激活剂配体 ( RANKL )水平和OPG /RANKL比率。在有或没有 50 nM 维生素D 3的情况下，在没有或有硫酸软骨素 (CS) (200 μg/mL )、硫酸葡萄糖胺 (GS) (50 或 200 μg/mL) 或两者 (各 200 μg/mL) 的情况下孵育的细胞中 OPG 的表达和产生 (a)、RANKL 的表达 (b) 以及 OPG/RANKL 的表达比率( c )。提取总 RNA 并进行定量聚合酶链式反应 (qPCR)，数据表示为平均值±任意单位平均值的标准误差。通过特定的酶联免疫吸附试验测定培养基中的OPG释放。数据来自八个独立实验。采用配对学生t检验，与自体对照进行比较，评估统计学意义。下划线p值表示对照组（C，基础条件）与维生素D 3处理组之间的统计学差异。

蛋白质水平的数据与OPG表达的数据几乎相同，但CS在基础和维生素D3条件下均显著提高了OPG 。GS单独或与维生素D3联合使用对OPG蛋白没有真正的影响。CS和GS共同孵育时OPG水平显著升高似乎是CS作用的结果。

CS和两种药物联合使用均显著降低了RANKL表达水平。这种下降似乎再次是CS效应的结果，因为GS在最高浓度下上调了RANKL的表达水平。维生素D 3显著上调了RANKL的表达。在这种情况下，CS单独使用以及与GS联合使用均倾向于下调RANKL水平。至于OPG，CS单独使用或与GS联合使用均获得了相似的值，这再次表明该效应与CS相关。

人类骨关节炎软骨下骨成骨细胞的促骨吸收活性。在存在巨噬细胞集落刺激因子以及存在或不存在硫酸软骨素 (CS) (200 μg/mL)、硫酸葡萄糖胺 (GS) (200 μg/mL) 或两者 (各 200 μg/mL) 以及存在或不存在 50 nM 维生素 D 3 的情况下，将成骨细胞与分化的外周血单核细胞共培养，测定其骨吸收活性。数据分别来自存在或不存在维生素 D 3的 9 个或 5 个独立实验。它们表示为用这些因子处理后每单位总表面的平均吸收表面数。通过与自体对照的配对学生t检验来评估统计学显着性。下划线的p值表示对照组（C，基础条件）和维生素 D 3处理样本之间的统计学差异。

骨转换是骨吸收和骨形成要素之间紧密平衡和协调作用的结果。这些要素受多种因素调节，包括细胞因子、生长因子和细胞外基质成分。后者包括蛋白聚糖和糖胺聚糖（GAG），例如壳聚糖（CS）、硫酸肝素和硫酸皮肤素，它们要么与细胞膜结合，要么储存在细胞外基质中。

近期 RANKL、其同源受体 RANK 及其诱饵受体 OPG 的发现，为破骨细胞/成骨细胞生物学和骨稳态研究开辟了新的分子领域视角。我们此前已证实，OA 软骨下骨成骨细胞可分为两个亚型，OPG和RANKL 的表达水平，以及因此而产生的OPG/RANKL表达比，随人类 OA 软骨下骨成骨细胞代谢状态的不同而不同：OPG/RANKL在 L-OA 成骨细胞中降低，而在 H-OA 成骨细胞中升高。此外，此前研究[ 11 ]以及 Couchourel 等人的研究显示，L-OA 成骨细胞的代谢状态促进骨吸收，而 H-OA 成骨细胞的代谢状态则有利于减少骨吸收。事实上，与 H-OA 成骨细胞相比，L-OA 成骨细胞中破骨细胞的分化水平更高，软骨下骨量更薄，而 H-OA 成骨细胞则表现出更高的骨沉积水平。由于我们想研究 CS 和 GS 对重塑过程的影响，我们选择了 L-OA 软骨下骨成骨细胞亚群。值得注意的是，来自人类软骨下骨的成骨细胞已被证实是成熟的分化细胞，它们表达并产生骨特异性标志物碱性磷酸酶，并且在维生素D3治疗后骨钙素的水平急剧升高。

GS 和 CS 都已作为治疗 OA 的治疗剂进行测试，尽管它们的临床疗效已得到证实，但它们起作用的机制尚不完全清楚。我们首先检查了 CS 和GS对碱性磷酸酶和骨钙素的影响，以评估这些药物是否可以改变终末分化成骨细胞的骨标志物水平。在用 CS 和 GS 处理后，两种骨表型细胞标志物在基础条件下均不受影响。此外，还用维生素 D3 处理细胞，维生素 D3已知可刺激骨钙素和碱性磷酸酶。正如预期的那样，维生素 D3提高了这两种骨生物标志物的水平，但 CS 和 GS 仍然没有进一步影响它们。这强烈表明这两种化合物对细胞完整性没有影响。

已知葡萄糖胺参与细胞内GAG和蛋白聚糖（如聚集蛋白聚糖）生成的增加。因此，按照上述思路，我们预计GS会产生与CS类似的效果。然而，用GS处理细胞时获得的OPG/RANKL表达比率并未增加。这可以通过以下方式解释：通过与GS的直接相互作用来调节细胞外OPG的可能性不大，因为GS作为单糖，对OPG肝素结合结构域的亲和力预计非常弱。事实上，已经证明，与含有更多糖（即六糖、八糖和十糖）的分子相比，即使是四糖对OPG肝素结构域的结合亲和力也非常低。

在RANKL非依赖性机制中，以下机制提供了有趣的假设。小蛋白聚糖，如核心蛋白聚糖和双糖链聚糖，由CS链组成。这些小蛋白聚糖能够隔离OA成骨细胞释放的转化生长因子-β (TGF-β)，从而抑制TGF-β对破骨细胞形成的直接刺激作用。此外，GS还在关节细胞（软骨细胞）中表现出RANKL非依赖性破骨细胞生成作用，通过抑制完成破骨细胞生成过程所需基因的表达。事实上，已经证明白细胞介素-1-β (IL-1β) 通过 RANKL 非依赖机制介导破骨细胞的多核化和活化，而用 GS 治疗可阻止 IL-1β 的作用）。GS还显示，在软骨细胞上， GS可直接抑制转录因子核因子 κB 的活化 ，从而阻止破骨细胞生成所需基因的活化。值得注意的是，在本研究中使用的吸收测定中，细胞与因子一起孵育长达 3 周；因此，药物对生长因子、细胞因子和转录因子的影响很可能占上风。因此，GS 通过 RANKL 非依赖机制，而 CS 通过 RANKL 依赖性和非依赖性机制，可以解释用这两种因子治疗后吸收减少的现象。

数据显示，维生素 D 3对 OPG 基因表达和蛋白质水平没有影响，但显著增加 RANKL，并因此显著抑制OPG/RANKL的表达比率。这些结果与最近的文献一致，表明维生素 D 3作用于成骨细胞，从而增加 RANKL并降低OPG。然而，在我们的研究中，尽管维生素 D 3降低了 OPG/RANKL 比率以有利于破骨细胞生成，但观察到吸收活性显著降低。这表明 RANKL 诱导的破骨细胞从分化的 PBMC/成骨细胞共培养体系分化被维生素 D 3显著抑制。维生素 D 3对 OA 成骨细胞吸收活性的抑制可能与该因素对破骨细胞的直接影响有关。事实上，当用维生素 D 3处理时，PBMCs 中 TRAP +和 VNR +（玻璃粘连蛋白受体+）多核细胞的形成明显减少，并表明该因子通过直接作用于破骨细胞前体来抑制破骨细胞生成。

维生素 D3以不同的方式调节OPG/RANKL表达比率，具体取决于成骨细胞的成熟阶段。因此，本研究与文献中的一些研究结果不同的原因可能是使用了 OA 患者的人类标本，成骨细胞已经成熟但处于疾病的特定阶段，并且成骨细胞来自软骨下骨。

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我们的研究提供了关于CS和GS对人类OA软骨下骨成骨细胞代谢影响的全新且有意义的数据。我们的数据表明，这些化合物单独或联合使用不会过度影响OA软骨下骨细胞。然而，CS显示出直接抑制OPG和RANKL（参与重塑过程的两个主要因子）生成的效果，而GS显著降低了骨吸收活性，因此，当CS和GS联合使用时，骨吸收活性显著降低。这些发现，加上探索这些化合物对OA分解代谢途径影响的研究结果，提供了关于这些药物如何对OA疾病进程产生积极作用的机制的有趣且富有洞察力的信息。

低钙饮食对肠道菌群及代谢组学的影响

采用线性判别分析效应大小（LEfSe）分析识别N组和C组肠道菌群的潜在生物标志物，并使用t检验进一步检验和可视化结果（P  <0.05；。共鉴定出22个显著分类单元。N组有16个肠道菌群潜在生物标志物，C组有8个。在此基础上，分析了两组中10种肠道菌群生物标志物与参与KEGG通路的20种粪便和血浆代谢物的相关性。结果表明，肠道菌群与粪便和血浆代谢途径之间存在很强的相关性。

碳酸钙对肠道菌群和代谢组学的影响

通过16S rRNA测序和代谢组学分析，我们将属于肠道菌群的潜在生物标志物与C组和Ca组粪便和血浆中的差异代谢物进行了比较，以阐明碳酸钙的作用机制。共鉴定出6个显著的分类单元，其中C组中明显存在Prevotella copri和Actinobacteria。同时，我们分析了C组和Ca组中10种肠道菌群生物标志物与参与KEGG通路的20种粪便和血浆代谢物之间的相关性。结果表明，肠道菌群与粪便和血浆代谢途径之间存在很强的相关性。为了评估Ca组的整体代谢变化，对C组和Ca组的粪便代谢物进行了测量和分析，采用LC-MS/MS。C组的粪便代谢物增加了42，减少了22。显示了参与产生不同代谢物的代谢途径。与 Ca 组相比，C 组代谢物的变化包括 AMP、GMP、PRPP 的上调以及孕酮和 17α-羟孕酮的下调。这些差异表达的代谢物在 KEGG 通路中富集，包括抗叶酸抵抗、嗅觉转导、皮质醇合成和分泌、库欣综合征和 cGMP-PKG 信号通路。这些通路可能被归类为抗肿瘤、感觉、内分泌和信号转导。C 组血浆代谢物比 Ca 组多 52 种，比 Ca 组少 2 种。碳酸钙干预下调了血浆烟酰胺，烟酰胺参与了长寿调节途径——蠕虫和血小板活化的 ADP。

碳酸钙改善低钙饮食引起的肠道菌群及代谢紊乱。A C组和Ca组的LEfSe进化树分析，LDA Score大于3。

硫酸软骨素对肠道菌群和代谢组学的影响

使用LEfSe鉴定表征肠道菌群特征的生物标志物，鉴定组间存在显著差异的分类群，并生成进化枝图谱。在C组和CS组的比较中，分别鉴定出6个和7个显著的分类群。具体而言，在C组存在梭菌（Clostridia）的两组比较中，CS组的Criobacteriaceae科、Collinsella科、Collinsella_aerofaciens科、Coriobacteriales科和Coriobacteriia科的数量较高。在C组与CS组的比较中，CS组的Lachnospiraceae科、Lachnospirales科、Alloprevotella科、Aeromonadales科、Succinivibrionaceae科、Anaerobiospirillum科和Clostridia科的数量较高。同时分析了C组和CS组中10种肠道菌群标志物与参与KEGG通路的20种粪便和血浆代谢物的相关性。结果表明，肠道菌群与粪便和血浆代谢途径之间存在很强的相关性。为了评估CS组的整体代谢变化，采用LC-MS/MS对C组和CS组的粪便代谢物和血浆代谢物进行了测定和分析。与C组相比，CS组粪便代谢物增加了11种，减少了8种。差异表达的代谢物富集在KEGG通路中的亚油酸代谢、卵母细胞成熟促进、色氨酸代谢和嘌呤代谢中。显示了参与产生不同代谢物的代谢途径。这些通路可能被归类为脂质代谢、内分泌系统、氨基酸代谢和核苷酸代谢。CS组血浆代谢物比C组多18种，比Ca组少21种。这些粪便代谢物和血浆代谢物具有多种结构，包括脂质、脂肪酸和氨基酸衍生物。

硫酸软骨素干预对大鼠排泄物及血浆代谢物的影响。A正常组与不同干预组粪便硬脂酸的差异。B正常组与不同干预组血浆睾酮的差异。C 、D不同干预组粪便短链脂肪酸水平。E硫酸软骨素组与低钙组谷胱甘肽水平差异。F硫酸软骨素干预对代谢途径的影响。

我们基于Novo自建代谢物数据库，从2200+个化合物对照中检测出843个化合物。在粪便和血浆差异代谢物的分析中，粪便中鉴定出的代谢物数量远多于血浆中的。在290+种脂质（100+种氧化脂质，190+种脂质）中，共检测到107种脂质，其中93种脂质存在差异，删除不匹配的条目，统计每个类别所含DEL的数量，得到脂质分类，排名最高的类别为脂肪酰基（FA）。正常喂养大鼠血浆睾酮及硬脂酸含量明显高于其他两组，说明长期低钙导致正常喂养大鼠血浆睾酮及粪便硬脂酸含量降低，补充钙和CS不能恢复。脂肪酸代谢物中，我们证实了粪便中短链脂肪酸的差异性变化，但在血浆中没有发现差异性变化。CS干预导致Ca组的氧代己二酸绝对含量高于C组，5-氨基乙酰丙酸和N-甲基-α-氨基异丁酸绝对含量低于C组，C组的4-甲基戊酸、羟基戊二酸和2-羟基-2-甲基丁二酸绝对含量低于Ca组。然而，在血浆代谢组学中，我们发现CS诱导抗氧化活性并降低氧化谷胱甘肽含量。

本研究利用16S rRNA测序以及粪便和血浆代谢物分析来评估骨质疏松大鼠模型粪便中的肠道菌群。我们发现，CS和碳酸钙的联合应用不仅能缓解骨质疏松症，还能影响肠道菌群的组成和代谢功能。一些改变的代谢物与肠道菌群紊乱具有功能相关性。本研究还发现，CS能够抑制骨质疏松大鼠的氧化应激。CS可能是一种很有前景的新型骨质疏松非药物治疗方法。

我们的研究结果首次证明低钙饮食可能导致肠道菌群比例和丰度发生显著变化。此外，CS可以部分恢复肠道紊乱。罗伊氏乳酸杆菌是本研究中三组动物中的优势菌种。先前的研究也表明，肠道菌群组成的变化与骨质疏松症的发生发展有关。

在本研究中，低钙饮食在门和属水平上显著减少了罗伊氏乳酸杆菌，增加了放线菌门和普雷沃菌门。厚壁菌门与钙的吸收呈正相关。它们激活破骨细胞并增加炎症。此外，我们发现厚壁菌门的乳酸杆菌（常用作益生菌）与钙缺乏有关。据报道，增加罗伊氏乳酸杆菌的丰度可防止骨质流失，这可能是因为乳酸杆菌具有抗肥胖和抗炎活性。有趣的是，研究发现骨矿物质密度与放线菌门成员（包括罗伊氏乳酸杆菌科）呈正相关。放线菌门成员的减少可能导致脂多糖易位到血清中，进而通过炎症途径导致骨量减少。这与我们的研究一致，我们的研究表明，罗伊氏乳酸杆菌与炎症性骨质流失有关，在骨质疏松大鼠的肠道中迅速增加并维持在高丰度[。研究表明，CS干预诱导的低钙大鼠肠道菌群中梭菌属水平较高和罗伊氏乳酸杆菌水平较低与骨质疏松症风险较高有关。肠道微生物过量产生脂多糖 (LPS) 会显著增加炎症因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和白细胞介素 (IL)-1β 的产生，从而引发炎症反应，导致骨矿物质丢失。与单纯补钙相比，CS 干预可显著上调肠道罗伊氏乳酸杆菌，参与肠道菌群稳态，降低肠道屏障和 LPS，并产生 SCFA，后者通过激活游离脂肪酸 2 和游离脂肪酸 3 受体和 GPR109A 或抑制组蛋白去乙酰化酶来调节炎症。代谢物感应 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 家族中的 GPR109A 可以抑制 Toll 样受体 (TLR)4 诱导的 TNFα、IL-6 和单核细胞趋化蛋白-1 的表达和分泌。

 TLR4 除了直接调节骨中的炎症反应外，还直接参与成骨细胞、破骨细胞和间充质干细胞的表达 。此外，SCFAs还能降低肠道pH值。酸性pH值刺激质子感应GPCR家族中T细胞死亡相关基因8，通过cAMP依赖性机制导致LPS刺激腹膜巨噬细胞后IL-6和TNFα的产生减少，参与抗炎反应，增加矿物质吸收。肠道菌群过度产生LPS可能通过炎症途径导致骨矿物质流失；然而，罗伊氏乳酸杆菌参与肠道菌群稳态、肠道屏障和LPS的降低，通过抗炎机制进一步抑制骨质疏松症。

根据既往研究，作为人类治疗药物，CS单独的生物利用度较低，仅占总口服摄入量的0-13%左右，且大多数能够降解CSA的菌株被归类为拟杆菌门。先前的许多研究发现拟杆菌的相对丰度与骨质疏松症呈正相关。在我们的研究中，CS降低了拟杆菌，这与以前的研究结果一致。罗伊氏乳酸杆菌是肠道菌群中骨质疏松症的生物标志物之一。罗伊氏乳酸杆菌可以将复杂的多糖分解为SCFAs ，从而介导微生物群引起的胰岛素样生长因子-1水平的变化，并有助于定植对骨转化的影响[ 44 ]。罗伊氏乳酸杆菌的丰度可能在骨代谢和骨折风险中发挥积极作用。事实上，虽然包括厌氧螺旋体在内的一些细菌有可能成为生物标志物，但这些细菌的研究很少，骨质疏松症发生和发展之间的具体机制仍不清楚。需要进一步的功能研究来验证这一假设。

先前的研究已经分析了补钙过程中微生物组成的变化，膳食钙通过罗伊氏乳酸杆菌显著增加，发挥了益生元的作用。此外，发现CS处理的小鼠可以增加乳酸杆菌和拟杆菌的丰度。在我们的研究中，低钙导致放线菌和普雷沃氏菌增加，乳酸杆菌减少。我们通过饲喂碳酸钙和硫酸软骨素来减轻低钙的影响，但CS补充可作为拟杆菌的外源底物。钙为罗伊氏乳酸杆菌的生长提供了充足的环境。这可能导致拟杆菌和放线菌维持在高水平，不能完全恢复。本研究的一个局限性在于，肠道菌群的结果仅是描述性的，缺乏相关的机制研究。因此，所有解释都只能视为推测。因此，需要进一步的机制研究，包 括粪便微生物组移植，以验证肠道微生物组在缺钙性骨质疏松症中的因果作用。

在我们的研究中，发现低钙饮食会影响粪便代谢组中的维生素 B6 代谢、溶酶体、泛酸和 CoA 生物合成以及 AMPK 信号通路。它还影响血浆代谢组中赖氨酸的降解。细菌衍生的化合物（如维生素）可能进入血液并直接影响骨细胞活性 。维生素 B6 缺乏也可能是骨质流失的一个危险因素。维生素 B6 是赖氨酸氧化酶胶原交联所必需的，对维持骨量起着至关重要的作用。同时，维生素 B6 缺乏会降低交联中间体的浓度并破坏骨骼中的胶原交联 。肠道微生物组罗伊氏乳酸杆菌通过代谢、内分泌和免疫通讯对宿主的骨代谢产生重大影响 。在我们的研究中，脂质占差异代谢物的很大一部分，尤其是 SCFA 和类固醇激素。此外，先前的研究表明，严重的维生素B6缺乏会改变组织脂质的脂肪酸谱，通常伴有亚油酸的增加和花生四烯酸的减少。短期维生素B6限制会降低血浆（n-3）和（n-6）多不饱和脂肪酸（PUFA）浓度，并且倾向于增加血浆（n-6）：（n-3）PUFA比率[。在先前的研究中，维生素B6是体内一些辅酶的组成部分，它通过参与各种代谢反应，包括氨基酸、蛋白质和雌激素代谢，来降低雌激素活性并降低体内雌激素水平。

雌激素是调节骨代谢的主要激素之一。男性的性类固醇激素和女性的骨骼发育和维持起着关键作用，除了雌激素之外，睾酮生物利用度低也可能更容易导致骨折。我们发现正常喂养大鼠血浆睾酮水平明显高于其他三组，长期低钙引起睾酮降低，可能无法通过补钙和添加硫酸软骨素来恢复。雌激素缺乏会影响骨细胞介导的重塑，降低骨量并破坏骨微结构。

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调节内分泌系统，平衡激素水平。

对于三十五岁以上女性的延缓衰老，改善女性更年期症状有很大的帮助。

另外异黄酮可以预防乳腺癌、降低血脂、改善骨质疏松。对男士前列腺炎效果好。

PM 倍力健

男士的加油站，女士的家气站

微生物群通过发酵膳食纤维进行生产，在脂质稳态中发挥重要作用。罗伊氏乳酸杆菌将可溶性玉米纤维发酵成乙酸盐或乳酸盐，而厚壁菌门进一步将这些底物发酵成丁酸盐，从而促进增加钙的吸收。短链脂肪酸，特别是丙酸盐和丁酸盐，作为内源性信号，通过抑制破骨细胞形成和骨吸收有效增加骨密度，而不直接影响成骨细胞功能 。

低钙饮食组补充碳酸钙后，影响了粪便代谢物的叶酸抵抗、嗅觉转导、皮质醇的生成和分泌、库欣综合征以及环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（cGMP-PKG）信号通路，以及血浆代谢物虫烟酰胺和血小板活化ADP的长寿调节通路。叶酸是一种水溶性维生素，通过维持骨细胞内最佳一氧化氮合酶活性来帮助维持骨密度。它还能显著改善骨矿物质密度和骨微结构，丰富AMPK信号通路，促进脂质氧化相关和抗氧化酶的表达。叶酸还参与炎症、同型半胱氨酸代谢和骨转换，直接或间接地作用于骨骼。

PM小红（艾特维）

主要的成份：

全族维生素B群（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12）、叶酸、褐藻、葡萄籽和瓜拉纳果等抗氧化物质。

功效：

迅速给我们的血液供氧，氧气贯穿全身的各个部位/毛细血管，尤其是末梢血管。

改善血液浓稠度和清除血液垃圾。

提升精神和专注力，燃烧脂肪。

它能促进细胞线粒体，产生能量，促进微循环，微循环不止，生命就不息。

提高精力，改善偏头痛，加强新陈代谢，帮助减肥和辅助运动。

促进红细胞形成及再生，预防贫血。

嗅觉传导途径和 cGMP-PKG 信号通路均上调 AMP 和 GMP，而非 cGMP-PKG 信号通路在骨骼稳态中起关键作用 。cGMP 通过激活 PKG 在成骨细胞分化中起关键作用，通过刺激芳香化酶表达导致局部雌激素的产生 。雌激素通过干扰糖皮质激素受体的功能和命运来拮抗糖皮质激素的作用，皮质醇水平的生理性变化也可能损害骨量 。过量皮质醇分泌导致骨代谢降低和骨结构改变 。此外，糖皮质激素引起的库欣综合征的体征和症状对骨骼和矿物质代谢有一系列全身和局部影响，与代谢综合征、肥胖症和骨质疏松症等常见疾病有重叠 。血浆富集脂质代谢途径中的差异代谢物烟酸和烟酰胺影响骨骼稳态。研究发现，血小板也通过调节骨形成和骨吸收在骨稳态中发挥关键作用。

但与碳酸钙组相比，CS干预下，粪便和血浆代谢物的脂质谱差异尤为显著，且粪便代谢的差异集中在亚油酸代谢上。亚油酸可能通过刺激钙的吸收间接影响骨量，从而对骨质丢失产生有益作用。我们还发现卵母细胞成熟前介导的色氨酸代谢和嘌呤代谢与骨质疏松症密切相关。此外，血浆代谢差异在谷胱甘肽代谢方面更为丰富。氧化应激是骨质疏松症的重要介质和指标，因为谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶在骨质疏松症中更为常见。与Ca组相比，CS粪便代谢物的KEGG通路中的cGMP-PKG信号通路以及成骨细胞中cGMP的抗氧化作用均由PKG2介导。 cGMP在内皮细胞中的抗氧化作用归因于PKG1转录后过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的上调。谷胱甘肽（GSH）的生物合成是通过氧化谷胱甘肽的还原来实现的，而GSH抑制由活性氧诱导的破骨细胞分化介导的核因子κB信号通路。因此，GSH/NRF2介导的抗氧化途径对于成骨作用和破骨细胞形成之间的平衡至关重要。CS血浆中的代谢物KEGG通路在生物素代谢中集中。生物素对正常的细胞功能、生长和发育至关重要。全身性生物素缺乏可导致发育迟缓、骨骼发育不良、免疫学变化和潜在的脑病。与单独使用碳酸钙相比，CS干预后粪便代谢物中短链脂肪酸（SCFA）的含量有所增加，肠道菌群中的酶活性能够消化碳水化合物并产生毫摩尔浓度的短链脂肪酸（SCFA）。动物模型已证实SCFA对骨形成的积极作用。SCFA通过直接抑制骨吸收、刺激钙吸收和产生免疫调节作用来调节骨稳态。在我们的研究中，CS通过增加SCFA的产生和促进钙的吸收来缓解骨质疏松症。

导致骨质疏松的机制有多种。但慢性低度炎症已被认定为包括骨质疏松症在内的许多疾病的根本原因。我们鉴定了这种变化背后的细菌和代谢物，尤其是脂质代谢，并讨论了它们与骨骼健康的相关性。事实上，先天免疫受体 TLR4 与骨质疏松症的发展有关。具体而言，TLR4 在成骨细胞介导的炎症活动中起着关键作用。尤其是前列腺素 E2 的产生是 TLR4 介导的骨质流失所必需的。此外，成骨细胞衍生的核因子 κB 配体 (RANKL) 决定 TLR4 介导的破骨细胞形成，过量的 TLR4 信号转导意味着骨质破坏 。我们关注的 SCFA 通过下调 TLR4 通路来减轻炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNFα 诱导的宿主炎症反应 。本研究为阐明骨质疏松症的分子机制和寻找潜在的生物标志物提供了新的策略。